HPLC液相色譜常見問題大全

HPLC液相色譜常見問題大全

第一章、簡要說明及一些必要的提示

當您遇到問題時，青青草黄色污需要先判斷問題出在什麽地方，最好的方法就是排除法，在其他條件不變的情況下，改變其中一個條件，如果問題依然沒有改變，則問題不是出在改變了條件的部分，然後再一個一個改變其他條件，直到找出可以影響問題結果的所有條件為止。

接下來，再看看這些對結果有影響的條件，有哪些條件是可以做適當調整的，然後再慢慢調整，直到得到滿意的結果為止。

如果以上方法不能得到滿意的結果，您就可能需要完全的更換某些條件，比如更換色譜柱，更換保護柱，更換接頭，更換溶劑等等。

本手冊將從四個方麵列出一些液相色譜中常見的問題，並對可能的原因一一分析，最後給出解決方法。這四個方麵如下：

• 1.壓力異常

• 2.漏液

• 3.譜圖問題

• 4.進樣閥問題

預防措施

許多液相色譜的故障是可以通過日常維護避免的，例如：定期的更換柱塞杆密封可 以避免柱塞密封的磨損以及由此產生的相關的故障。第六章列出了很多液相色譜的常見故障以及預防措施及建議。您需要針對您的色譜儀器類型靈活調整這些建議並使之成為實驗室日常維護工作的一部份。

第二章、常見問題之壓力異常

操作壓力的變化往往是故障的征兆，從下列原因中找出最接近的現象，並在右側的 列表中找出相應的解決方法。

• 沒有壓力顯示，沒有流動相流動                                  表1

HPLC液相色譜常見問題大全

原因	解決辦法
電源問題	接通電源、開機
保險絲被燒壞	更換保險絲
控製器設定不正確或設定失敗	a. 采取恰當的設定 b. 修理或更換控製器
柱塞杆折斷	更換柱塞杆
泵頭內有空氣	溶劑脫氣、啟動泵抽出空氣
流動相不足	a. 補充流動相 b.   更換入口篩板
單向閥損壞	更換單向閥
漏液	擰緊或更換手緊接頭

 

• 流動相流動正常，但沒有壓力顯示                                表2

 

原因	解決方法
儀表損壞	更換儀表
壓力傳感器損壞	更換壓力傳感器

 

C、壓力持續偏高                                                  表3

原因	解決方法
流速設定過高	調整流速設定
柱前篩板堵塞	a. 在允許情況下反衝色譜柱 b. 更換篩板* c. 更換色譜柱
流動相使用不當或緩衝鹽的結晶沉澱	a．使用恰當的流動相 b．衝洗色譜柱
色譜柱選擇不當	選擇恰當的色譜柱
進樣閥堵塞	清洗或更換進樣閥
柱溫過低	提高溫度
控製器失常	修理或更換控製器
保護柱阻塞	清洗或更換保護柱
在線過濾器阻塞	清洗或更換在線過濾器

 

D、壓力持續偏低                                                  表4

原因	解決方法
流速設定過低	調整流速
係統漏液	確定漏液位置並維修
色譜柱選擇不當	選擇恰當的色譜柱
柱溫過高	降低溫度
控製器失常	維修或更換控製器

 

E、壓力不斷上升

原因	解決方法
見表3	見表3

 

F、壓力降為零

原因	解決方法
見表1和2	見表1和2

 

G、壓力不斷下降，但不回零

原因	解決方法
見表4	見表4

 

H、壓力波動

原因	解決方法
泵中有氣體	a. 溶劑脫氣 b. 從泵中除去氣體
單向閥損壞	更換單向閥
泵密封損壞	更換泵密封
脫氣不充分	a. 溶劑脫氣 b. 改脫氣方法(使用在線脫氣法等)
係統漏液	確定漏液位置並維修
使用梯度洗脫	由於流動相粘度的變化引起的壓力波動是正常的

 

第三章、常見問題之漏液

通常漏液問題可以靠擰緊或更換管路接頭來解決，但值得注意的是過度擰緊會導致 金屬接頭的漏液和塑料接頭的磨損。如果通過稍微擰緊接頭不能解決漏液，就必須 將接頭取下，檢查是否損壞(例如：卡套損壞、密封表麵有雜質)；損壞的接頭應該更換掉。

A、接頭處漏液

原因	解決方法
接頭鬆動	擰緊
接頭磨損	更換
接頭過緊	a.       擰鬆，再重新擰緊 b.      更換接頭
接頭被汙染	a. 拆下清洗 b. 更換接頭
部件不匹配	使用同一品牌的配件

 

B、泵漏液

 

原因	解決方法
單向閥鬆動	a. 擰緊單向閥(不必擰得過緊) b. 更換單向閥
接頭鬆動	擰緊接頭(不必擰得過緊)
混合器密封損壞	a. 更換混合器密封 b. 更換混合器
泵密封損壞	維修或更換泵密封件
壓力傳感器損壞	維修或更換壓力傳感器
脈衝阻尼器損壞	更換脈衝阻尼器
比例閥損壞	a. 檢查隔膜，如果漏液立即更換 b. 檢查手緊接頭，如果損壞立即更換
放空閥損壞	a. 擰緊放空閥 b. 更換放空閥

 

C、進樣閥漏液

原因	解決方法
轉子密封損壞	重新安裝或更換進樣閥
定量環阻塞	更換定量環
進樣口密封鬆動	調整
進樣針頭尺寸不合適	使用恰當的進樣針
青青草网站黄管阻塞	更換青青草网站黄管
青青草网站黄管中產生虹吸	保持青青草网站黄管高於青青草网站黄液麵

 

D、色譜柱漏液

原因	解決方法
尾端接頭鬆動	擰緊接頭
卡套內有填料	拆下、清洗卡套、重新安裝
篩板厚度不合適	使用合適的篩板(參考下表)

篩板選擇指南

填料粒徑	篩板孔徑
2-4um	0.5um
5-20um	2um

 

E、檢測器漏液

原因	解決方法
流通池墊片損壞	a. 避免過大的背壓 b. 更換墊片
流通池窗破碎	更換窗片
手緊接頭漏液	擰緊或更換
青青草网站黄管阻塞	更換青青草网站黄管
流通池阻塞	重新安裝或更換

 

第四章、常見問題之譜圖問題

液相色譜係統的許多問題都能在譜圖上反映出來，其中有一些問題可以通過改變設 備參數得到解決，而其它問題必須通過修改方法來解決問題。選擇正確色譜柱和流 動相是得到好的色譜圖的關鍵。

A、峰拖尾

原因	解決方法
篩板阻塞	a. 反衝色譜柱 b. 更換進樣口篩板 c. 更換色譜柱
色譜柱塌陷	填充色譜柱/更換色譜柱
幹擾峰	a. 使用更長的色譜柱 b. 改變流動相/或更換色譜柱
流動相pH選擇錯誤	調整pH值，對於堿性化合物的分離， 低pH值可使峰形更對稱
樣品與填料的活性位點發生反應	a.       加入離子對試劑或揮發性堿性改 性劑 b. 更改色譜柱

 

B、峰前延

原因	解決方法
柱溫低	升高柱溫
樣品溶劑選擇不恰當	使用流動相作為樣品溶劑
樣品過載	降低樣品含量
色譜柱損壞	反衝或更換色譜柱

 

C、峰裂分

 

原因	解決方法
保護柱或分析柱進樣口汙染	取下保護柱再分析： 若有需要，應更換保護柱 若是分析柱進樣口堵塞，拆下來清洗。 如果分析柱阻塞，可以反衝色譜柱。 如果問題仍然存在，可能是色譜柱被強 保留物質汙染，可運行適當的再生措 施。如果仍不能解決問題，可能是進樣 口堵塞，可以更換篩板或色譜柱。
樣品溶劑不溶於流動相	改變樣品溶劑。如果可能，使用流動 相為樣品溶劑。

 

D、大峰變形

原因	解決方法
樣品過載	減少進樣量

 

E、較早洗脫峰變形

原因	解決方法
樣品溶劑選擇不恰當	a. 減少進樣體積 b. 用更弱的溶劑

 

F、較早洗脫出的峰拖尾程度大於較晚洗脫出的峰

原因	解決方法
柱外效應	a.        調整係統連 (使用更短、內徑更小的管路) b. 使用小體積的流通池

 

G、容量因子(k’)增加時，拖尾更嚴重

原因	解決方法
二級保留效應，反相模式	a.       加入三乙胺(堿性樣品) b.      加入乙酸(酸性樣品) c.       加入鹽或緩衝劑(離子型樣品) d.      更換色譜柱
二級保留效應，正相模式	a.       加入三乙胺(堿性樣品) b.      加入乙酸(酸性樣品) c.       加入水（多官能團化合物），僅適 用於使用水溶性流動相的正相方法 d. 試用另一種液相色譜方法
二級保留效應，離子對	加入三乙胺(堿性樣品)

 

H、酸性或堿性化合物的峰拖尾

原因	解決方法
緩衝液不合適	a.       使用濃度50-100mM的緩衝液 b.      使用與流動相pH值相等pKa的緩 衝液

 

I、額外的峰

原因	解決方法
樣品中有其他化合物	正常
前一次進樣未洗脫出的峰	a.       增加運行時間或梯度斜率 b.      提高流速
空缺或鬼峰（購買專門的鬼峰消除小柱，解決鬼峰問題）點擊這裏獲取鬼峰柱信息	a.       檢查流動相是否純淨 b.      使用流動相作為樣品溶劑 c.       減少進樣體積
汙染	過濾樣品

 

J、保留時間改變（保留時間在5%左右波動一般被視為正常）

原因	解決方法
溫控不當	維持柱溫不變
流動相變化	防止變化(蒸發、反應等)
色譜柱平衡不充分	在每一次運行之前給予足夠的時間平 衡色譜柱

 

K、保留時間突然變化

原因	解決方法
流速變化	重新設定流速
泵中有氣泡	從泵中除去氣泡
流動相選擇不恰當	a.       更換合適的流動相 b.      檢查流動相混合器

 

L 、基線漂移

原因	解決方法
柱溫波動(即使是很小的溫度變化都會引起基線的波動。通常影響示差折光檢測器、電導檢測器或較高靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器)	控製好柱子和流動相的溫度，在檢測器之前使用熱交換器
流動相不均一(基線向上漂移，流動相條件變化引起的基線漂移大於溫度導致的漂移)	使用色譜純溶劑、高純度的鹽和添加劑。流動相在使用前進行脫氣，使用過程中用氦氣
流通池被汙染或有氣體	用甲醇或其他強溶劑衝洗流通池，如有需要，可以用1N的硝酸清洗 (不要用鹽酸)
檢測器出口阻塞(高壓造成流通池窗破裂，產生基線噪音)	清理阻塞物或更換管路。參考檢測器手冊更換流通池窗
流動相配比不當或變動流速	調整配比或流速。為避免這個問題可定期檢查流動相組成及流速
柱平衡慢，特別是更換流動相時	用中等強度的溶劑進行衝洗，在分析 前用10-20倍柱體積的新流動相對柱子進行衝洗
流動相汙染、變質或由劣質溶劑配成	檢查流動相的組成。使用優質化學試劑及色譜純溶劑
樣品中有強保留的物質(高k’ 值) 以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現出一個逐步升高基線(梯度分析會使其加劇)	使用保護柱，如有必要，在進樣之間或在分析過程中定期使用強溶劑衝洗柱子
循環使用流動相，但檢測器未調整	重新設定基線。如循環流動相已超出檢測器檢測範圍，使用新的流動相
檢測器(UV)沒有設定在最大吸收波長處	將波長調整至最大吸收波長處

 

M、基線噪音(規則的)

原因	解決方法
在流動相、檢測器或泵中有空氣	流動相脫氣，衝洗係統以除去檢測器或泵中的空氣
漏液	見第三章。檢查管路接頭是否鬆動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換泵密封
流動相混合不完全	用人工配置流動相或使用低粘度的溶劑
溫度影響(柱溫過高，檢測器未加熱)	減少差異或使用熱交換器
在同一條線上有其他電子設備	斷開LC、檢測器和記錄儀，檢查幹擾 是否來自外部，加以更正
泵脈衝	在係統中加入脈衝阻尼器

 

N、基線噪音(不規則的)

原因	解決方法
漏液	見第三章。檢查管路接頭是否鬆動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換密封。 檢查檢測器流通池是否漏液
流動相汙染、變質或由劣質溶劑配成	檢查流動相的組成
流動相溶劑不互溶	選擇互溶的流動相
檢測器/記錄儀電子元件問題	斷開檢測器和記錄儀的電源，檢查並 更正
係統內有氣泡	用強溶劑衝洗係統
檢測器內有氣泡	衝洗檢測器，在檢測器後麵安裝背壓 調節器
流通池汙染(即使是極少的汙染物也會產生噪音)	用1N的硝酸(不能用鹽酸)清洗流通池
檢測器燈能不足	更換氘燈
色譜柱矽膠或填料流失	更換色譜柱
流動相混合不均勻或混合器工作不正常	維修或更換混合器，在使用等度模式 時，建議離線流動相配製

 

O、寬峰

原因	解決方法
變動流動相組成	重新配製流動相
流動相流速太低	調節流速
漏液(特別是在柱子和檢測器之間)	見第三章，檢查管路接頭是否鬆動，泵是否漏液、是否有鹽析出和不正常的噪音。如果必要，更換密封
檢測器設定不正確	調整設定
柱外效應 a.       柱子過載 b.      檢測器響應時間過長或流通池體積過大 c.       柱子與檢測器之間的管路太長或管路內徑太大 d.      記錄儀響應時間太長	a.       減少上樣量(如10μL vs. 100μL) 或1:10和1:100稀釋樣品 b.      減少響應時間或使用更小的流通池 c.       使用內徑為0.005 - 0.007英寸的較短管路 d.      減少響應時間
緩衝液濃度太低	增加濃度
保護柱汙染或失效	更換保護柱
色譜柱汙染或失效，塔板數較低	更換同樣類型的色譜柱
柱入口塌陷	更換柱子
洗脫出的峰含有兩個或多個未被完全分離的化合物	選擇其它類型的色譜柱以改善分離效果
柱溫過低	提高柱溫。除非色譜柱製造商注明，否則溫度不宜超過60°C
檢測器時間常數太大	使用較小的時間常數

 

P、分離度低

原因	解決方法
流動相汙染或變質(引起保留時間變化)	重新配製流動相
保護柱或分析柱阻塞	取下保護柱再分析，如需要可更換保護柱，若是分析柱堵塞，可反衝色譜柱，如果問題仍然存在，可能是柱子被強保留物汙染，可運用適當的再生措施，若還不行，可能是入口處堵塞，可以更換篩板或色譜柱

 

Q、所有的峰麵積都太小

原因	解決方法
檢測器衰減設定過高	降低衰減設定
檢測器時間常數設定太大	設定較小的時間常數
進樣量過低	a.       增加樣品濃度 b.      如果柱規格允許，增大進樣量
記錄儀連接不當	正確連接記錄儀

 

R、所有的峰麵積都太大

原因	解決方法
檢測器衰減設定過低	提高衰減設定
進樣量過高	a.       降低樣品濃度 b.      減少進樣量，使用更小的樣品定量環或部分定量環進樣
記錄儀連接不當	正確連接記錄儀

 

第五章、進樣閥的問題

以下問題在使用進樣閥過程中有可能產生。

進樣閥漏液問題及其解決方法已經在第三章介紹過。

A、手動進樣閥，轉動不靈

原因	解決方法
轉子密封損壞	更換或調整轉子密封
轉子太緊	調整轉子的鬆緊度

 

B、手動進樣閥，進樣困難

原因	解決方法
進樣閥安裝不當	重新安裝
定量環阻塞	更換定量環
進樣針汙染	清洗或更換進樣針
管路阻塞	清洗或更換管路

 

C、自動進樣閥，不能轉動

原因	解決方法
無氣壓(或電源)	提供恰當的壓力(電源)
轉子太緊	調整轉子的鬆緊度
進樣閥安裝不當	重新安裝

 

D、自動進樣閥，其它問題

原因	解決方法
阻塞	清洗或更換阻塞部件
機械故障	見隨機維修手冊
控製器故障	維修或更換控製器

 

第六章、常見故障及日常預防維護

下表中列出了液相色譜操作中常見的一些問題，右側中則列出日常維護的方法以減 少問題出現的頻率。 儀器自帶的用戶手冊則提供您更多的維護方法。

A、溶劑瓶

原因	預防維護
入口過濾器阻塞	a.       更換(每3-6個月) b.      過濾流動相，0.5µm濾膜
氣泡	流動相脫氣

 

B、泵

原因	預防維護
氣泡	流動相脫氣
泵密封損壞	更換(每3個月)
單向閥損壞	過濾流動相、使用入口過濾器，準備 備用單向閥

 

C、進樣閥

原因	預防維護
轉子密封損壞	a.       不要擰的過緊 b.      過濾樣品

 

D、色譜柱

原因	預防維護
篩板阻塞	a.       過濾流動相 b.      過濾樣品 c.       使用在線過濾器或保護柱
柱頭塌陷	a.       避免使用pH>8的流動相 (針對大部 分矽膠的色譜柱) b.      使用保護柱 c.       使用預柱(飽和色譜柱)

 

E、檢測器

原因	預防維護
氘燈失效，檢測器響應降低，噪音擴大	更換(每6個月)或準備備用燈
流通池有氣泡	a.       保持流通池清潔 b.      池後使用反壓抑製器 c.       流動相脫氣

HPLC液相色譜常見問題大全

特別提示：汙染物會導致下列問題

 • 背壓升高

• 峰裂分

• 峰展寬

• 基線噪音

• 基線漂移

• 分離度降低

• 色譜柱的永久損壞

 • 係統損壞

建議使用HPLC保護柱來保護您的HPLC色譜柱和結果，點擊這裏獲取保護柱信息。